Первый секвенированный геном вируса PVY в России
|
Даты проведения с 2020-07-15 по 2021-06-24 |
Картофель – одна из важнейших продовольственных культур в мире. Поэтому заболевания, которым он подвержен могут наносить огромный ущерб. Для картофеля наибольшую опасность представляют вирусные заболевания, так как его размножают вегетативно. У растений, которые размножаются генеративно, есть естественный барьер между растением и его семенами, поэтому в следующие поколения вирусы не могут попасть, у картофеля же весь вирус накапливается в клубнях и передается из поколения в поколение. Одним из самых распространённых и опасных вирусов является вирус картофеля Y (PVY). Он поражает множество растений из семейства Паслёновые и наносит огромный экономический ущерб по всему миру. Актуальность этого вируса подтверждают сотни секвенированных геномов из разных стран, представленные в базе данных NCBI. В ней представлены последовательности геномов PVY из разных стран мира (США, Китай, Франция, Кении и т.д.), но, к сожалению, в NCBI нет ни одного сиквинса из России, что странно, ведь картофель одна из основных сельскохозяйственных культур в нашей стране, а PVY распространён во всех регионах, где выращивают картофель.
Таким образом, целью нашей работы является: получение первого в России полной последовательности генома вируса РVY.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1) Выделение вирусной РНК из заражённого растения картофеля 2) Наработка небольших фрагментов генома вируса 3) Секвенирование фрагментов и получение полной последовательности генома Для работы на полевой станции Тимирязевской академии был взят образец картофеля с симптомами заражения PVY. Из листьев была выделена РНК с помощью реактива ExtractRNA (Евроген, Россия).
Замороженные в жидком азоте листья растирались в ступке и к ним добавлялся реактив. После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут добавляли хлороформ и с помощью центрифугирования изолировалась фаза, содержащая растворенную РНК. С полученной РНК с помощью специфичного праймера была запущена обратная транскипция и получена кДНК.
Для секвенирования генома по Сэнгеру было решено разделить вирус на 13 перекрывающихся фрагментов, так как таким методом за раз можно секвенировать до 1000 нуклеотидов, тогда как геном вируса - около 10000 нуклеотидов. Фрагменты вируса нарабатывались методом Полимеразной Цепной Реакции (ПЦР) с использованием амплификатора Терцик (ДНК-технология, Россия). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле. Фрагменты вырезались из геля и очищались с помощью набора Cleanup S-Cap (Евроген, Россия) и секвенировались в ЦПК «Биотехнология» ФГБНУ ВНИИСБ. Полученные сиквенсы анализировались с помощью программного обеспечения SnapGene, USA.
В результате, была получена полная последовательность генома российского PVY. Сравнение его с геномами, представленными в NCBI, показал, что он относится к штамму NTN. Данный штамм является наиболее распространённым и наносит существенный вред сельскому хозяйству. В дальнейшем планируется брать большее количество растений, зараженных PVY, и анализировать их по уже отработанной методике. Полученные результаты являются основой для создания надёжных диагностических систем вируса Y в России. Кроме того, разработанную методику можно использовать для анализа геномов вируса по всей России. Эти данные важны для изучения распространения и эволюции PVY по всему миру
Проект опубликовал
