План и перспективы разработки антитела для α-конотоксина моллюсков семейства Конусы (Conidae)

Известно, что α-конотоксин является отравляющим веществом в составе яда хищного брюхоногого моллюска из семейства Конусы (Conidae). Яд ингибирует никотиновые ацетилхолиновые рецепторы нервной и мышечной тканей, что приводит к блокировке пропускания нервных импульсов по ткани, вызывая паралич. Это свойство позволяет использовать конотоксины в фармакологии. Например, на их основе делают обезболивающие препараты, не вызывающие зависимости. В чрезвычайно малых дозах α-конотоксин невреден человеку. Однако при превышении концентрации выше ЛД50 0,01 мг/кг, высока вероятность летального исхода. В связи с этим у нас появилась гипотеза, что существуют антитела, которые могут предотвратить действие пептида на организм. Чтобы проверить это мы поставили цель: разработать способ синтеза антител, способных подавить действие α-конотоксина. Актуальность создания таких антител особенно важна для тех районов, где количество моллюсков очень велико, и по данным медицинских органов здравоохранения число смертей и отравлений от моллюсков превосходит количество погибших и пострадавших от встречи с акулами. Разработка способа синтеза антител позволит снизить число несчастных случаев с отдыхающими.

Задачи: 1) Создать план разработки моноклонального антитела к α-конотоксину 2) Рассчитать систему производства антител с максимально низкой себестоимостью Для создания антитела нам необходимо синтезировать плазмиду, в которой будет закодирована последовательность аминокислот, способных синтезировать антитело.

К сожалению, в данный момент развития биоинформатики, мы не имеем технологий, способных предсказать последовательность аминокислот в составе искомого антитела. Поэтому здесь мы воспользуемся лабораторными методами. Первым этапом будет занесение антигена в организм, синтезирующий антитело. В нашем случае антиген - α-конотоксин, организм – трансгенная мышь. Трансгенные мыши используются в лабораторных исследованиях с 1994 года. Их преимущество над обычными мышами – наличие гена иммуноглобулина человека (Ig), с помощью которого они могут синтезировать полностью человеческие антитела, не нуждающиеся в гумманизации. Вторым этапом будет добыча В-клеток иммунизированной мыши. В-лимфоциты в большом количестве содержатся в селезенке. Путем хирургического вмешательства изымаем селезенку и помещаем ее в среду, пригодную для жизни антител. Третий этап – обеспечение продолжительности жизни В-клеткам. Вклетки не являются бессмертными, в связи, с чем нам необходимо провести их слияние с постоянно делящимися раковыми клетками. Теперь перед нами стоит другая задача – узнать последовательность аминокислот, входящих в состав антитела, то есть провести секвенирование пептида. Для этого нам понадобится секвенатор, работающий по методу Эдмана. И вот мы получили порядок аминокислот в пептиде. Дело в том, что in vitro повторить условия in vivo необычайно трудно, поэтому любое отклонение может повлиять на скручивание пептида, на соединение тяжелого и легких частей антитела. В связи с этим, мы приняли решение не синтезировать полноценное антитело, а только его scFv фрагмент, то есть одноцепочный вариабельный фрагмент. В его состав входит только антигенраспознающий участок антитела. Следующий этап – создание плазмиды для синтеза антитела. Мы посчитали, что наиболее удобным организмом для выращивания антител является фаг λ. После замены ДНК в нуклеоиде фага его выпускают в бактериальную культуру. Теперь нам следует полагаться на природные процессы: передвижение фага, встраивание его ДНК в ДНК бактерий, размножение бактерий. Чтобы обеспечить наше исследование точностью, а именно исключить из культуры незаразившихся бактерий, можно встроить в ДНК фага такой ген, который изменит необходимые условия среды для жизнедеятельности организма. Вот мы получили антитело для α-конотоксина. Теперь необходимо увеличить масштаб его синтеза. Производство антител – сложный процесс, требующий большого внимания к мелочам. Например, для культивации продуцентов в биореакторе больше подходят одноразовые контейнеры, так как они 15 обладают большей гибкостью в случае необходимости изменения параметров среды, поставляются стерильными и их не нужно долго вводить в эксплуатацию и очищать в случае контаминации. Полезным введением в процесс будет переход к перфузионному культивированию, при котором свежая среда непрерывно добавляется к клеточной культуре, а продукт удаляется из нее. В качестве клетки-продуцента мы используем кишечные палочки, в связи с их быстрым размножением, а как следствие, большим выходом продукта. Для очистки полученного продукта будем использовать метод аффинной хроматографии.

В ходе моей работы было проведено большое исследование, которое помогло сделать мне ряд выводов: I. Создание антител большой и трудоемкий процесс, включающий в себя несколько этапов: поиск мишени, иммунизация, выделение антител, изучение фармокинетики антител, повышение аффинности антител, создание плазмиды, вживление плазмиды в организм-продуцент; II. Современные технологии позволяют создать антитела без использования дорогостоящего оборудования или специального производства, для создания будет достаточно обычной лаборатории; III. Рассчитанная технология позволяет пропустить несколько ресурсозатратных этапов, среди которых гумманизация антитела. Данная перспектива очень полезна для биотехнологов, особенно в сложившейся эпидемиологической ситуации.

Обзор литературных источников 1. https://biomolecula.ru/articles/metody-vkartinkakh... 2. https://jbiomedsci.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12929- 019- 0592-z 3. https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-vkartin... 4. https://biomolecula.ru/articles/12-metodov-v-karti... 5. https://biomolecula.ru/articles/biotekhnologiiaant... 6. е https://biomolecula.ru/articles/biotekhnologiia-an... 7. https://swissmodel.expasy.org/repository/uniprot/P... EE90F8C2E19 8. http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/cgibin... pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=1hje 9. Биологическая химия учебник 10-11 классы Я. С. Шапиро 2010 год 10. Органическая химия в трех томах В. Ф. Травень 2018 год 11. Практическая биология для олимпиадников П. В. Волошина 2020 го

• Цели
• Задачи
• Актуальность
• Результаты
• Применение
• Оборудование